在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所等研究机构的研究人员发现酿脓链球菌Cas9（SpCas9）的首批小分子抑制剂能够更精确地控制基于CRISPR-Cas9的基因组编辑。具体而言，他们通过开发一系列高通量生物化学分析方法和基于细胞的分析方法，筛选了许多小分子，以便鉴定出能够破坏SpCas9与DNA结合因而干扰它的DNA切割能力的化合物。
这些首批小分子CRISPR-Cas9抑制剂很容易进入细胞，并且比之前发现的抗CRISPR蛋白小得多。这些新化合物可以对基于SpCas9的编辑技术进行可逆的和剂量依赖性的控制，包括它们在哺乳动物细胞中进行基因编辑、碱基编辑和表观遗传编辑的应用。相关研究结果发表在2019年5月2日的Cell期刊上，论文标题为“A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9”。
论文通讯作者、布罗德研究所的Amit Choudhary说道，“这些技术为快速鉴定和使用针对SpCas9和下一代CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂奠定了基础。靶向CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂具有广泛应用于基础研究、生物医学和国防研究以及生物技术应用的潜力。”
当前，SpCas9正在开发作为多种疾病（包括艾滋病、视力障碍、肌肉萎缩症和其他遗传性疾病）的基因治疗试剂。但是，这些治疗应用将极大地受益于对SpCas9活性的剂量和时间安排进行精确控制以减少脱靶效应。控制SpCas9活性的这些方面也可能使其他应用受益，比如对模型生物的DNA进行高效编辑来构建疾病模型和研究疾病，以及在基因工程蚊子中使用基因驱动来遏制疟疾和其他蚊子传播疾病。
对SpCas9的剂量和时间控制的需求已产生了对抗CRISPR分子的需求。尽管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但是它们是大分子，不易渗透到细胞中，起着不可逆的作用，可被蛋白酶分解，并且可能在体内存在引起不良免疫反应的风险。相反，小分子抑制剂在蛋白水解上是稳定的，可逆的，通常是非免疫原性的，并且能够通过被动扩散轻松地递送到细胞中。此外，它们可以低成本地大规模合成，具有很小的批间差异。
在这项新的研究中，Choudhary及其团队推出了一个强大，灵敏且可扩展的平台，用于快速、经济地鉴定和验证SpCas9的小分子抑制剂。鉴于SpCas9酶的特性，以高通量方式测量CRISPR-Cas9活性从而进行药物筛选一直是具有挑战性的。为此，Choudhary团队分别开发了针对SpCas9-DNA结合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初级和二级测定方法。对于初级测定，他们使用一种称为荧光偏振的生物化学技术来监测SpCas9与含有PAM序列的经过荧光团标记的DNA片段之间的相互作用。在二级测定中，他们使用自动显微镜来测量在细胞中由SpCas9介导的对报告基因进行DNA切割后产生的荧光变化。
通过使用这些测定方法，这些研究人员首先筛选了多种类型小分子的代表成员，以确定其成员经常抑制SpCas9的小分子类型。他们鉴定出两种先导化合物，它们以剂量依赖性方式破坏了哺乳动物细胞中SpCas9结合DNA和抑制SpCas9介导的DNA切割的能力。鉴于这些小分子阻断这种酶结合DNA，因此它们还抑制SpCas9的催化活性受到破坏的编辑技术，包括用于转录激活的那些技术，而且在人血浆中是稳定的。
Choudhary说，“这些结果为对CRISPR-Cas9活性的精确化学控制奠定了基础，从而能够安全地使用这些技术。然而，这些分子还没有为人类应用做好准备，也没有在生物体内进行功效测试。”
在未来的研究中，这些研究人员计划鉴定这些抑制剂在SpCas9:gRNA复合物上的结合位点，研究它们的作用机制，并优化它们的功效。他们还将确定这些分子是否与哺乳动物细胞中的其他靶标相互作用，并评估它们对其他的CRISPR相关核酸酶的特异性。这项新研究的早期结果表明这些分子对它们的靶标极具特异性，这是因为它们对与SpCas9的亲缘关系较远的CRISPR相关酶Cas12a没有影响。
参考资料：Basudeb Maji et al. A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9. Cell, 2019, doi:10.1016/j.cell.2019.04.009.
原标题：Cell：首次发现阻断CRISPR-Cas9基因组编辑的小分子抑制剂